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安徽快三是不是真的:教你如何正確選擇二抗

作者:admin 信息來源:達科為 日期:20150605 打印 字體:  
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通常情況下,某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇,如何能選擇到適合該實驗的二抗,需要綜合以下幾個方面進行考慮:


一抗的物種來源


一抗是在什么物種來源的,相應的二抗也要是抗該物種的抗體。例如,如果一抗是在小鼠體內制備的,那么你就應當選擇抗小鼠的二抗,如果一抗是在兔體內制備的,那么二抗就應當是抗兔的抗體。至于二抗本身是在什么動物中制備的對二抗的質量并無明顯的影響。


一抗是屬于哪個類或亞類


二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白,因此相應的二抗就是抗IgG抗體。


單克隆抗體的類別及亞類通?;嵩誆妨斜碇辛諧?,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgM,或是抗小鼠IgG抗體。


如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合,或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以選擇抗IgG1的二抗,此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。


如果你不知道一抗是哪一類別或亞類,那么抗小鼠IgG是一個不錯的選擇,因為此種抗體可以識別大多數類型的IgG免疫球蛋白。


二抗的特異性

 


下面總結了幾種具有不同特異性的二抗:針對整個抗體分子(HL)具有特異性:如抗IgG(H+L),此類抗體既可以與抗體的重鏈結合也可以與輕鏈結合,即與抗體分子的Fc,F(ab)2/Fab部分(見圖5)均可反應,抗IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(如IgMIgA),因為所有的免疫球蛋白都具有相同的輕鏈(kappa鏈或lambda鏈)。


針對Fab片段具有特異性:這類抗體與重鏈輕鏈均可以結合,由于它們可以與輕鏈反應,它們同時也已和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應。


這對Fc片段或重鏈具有特異性:這類抗體和重鏈的Fc部分反應,一次它們是類別特異性的(即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應,mu鏈特異性抗體只識別IgM,依此類推)。


輕鏈(kappa,labmda)特異性:與所有類別的抗體反應,因為所有類別的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。


經過吸附處理的二抗(cross-absorbed):不同來源的免疫球蛋白含有相似的結構,抗一個物種的抗體可能與其他物種發生交叉反應,一次有些二抗經過了動物或人類IgG吸附處理,以減少非特異性背景。例如,如果是小鼠的組織或細胞,那么選擇經小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結合。但是此種抗體識別表位的數量被大大減少。


二抗的形式


選擇哪種形式的二抗,是整個IgG分子,F(ab)2片段,還是Fab片段?


整個IgG分子:此種抗體適用于多數情況。


F(ab)2片段:該種抗體是由兩個靠二硫鍵連接的用于結合抗原的Fab片段組成,這些抗體用在特定的情況中,如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況。


Fab片段:它們只有一個結合位點,一般用來封閉內源性免疫球蛋白。


二抗的偶聯標記


一般來講,耦聯到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),熒光基團(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blotELISA,常用的二抗是酶標二抗,而細胞或組織標記實驗(細胞免疫化學,組織免疫化學,流式細胞術)中通常使用熒光基團標記的二抗,免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號,可以使用biotin/avidin檢測系統。


下面簡單介紹幾種二抗探針的優缺點及其適用的實驗:


酶:主要有兩種不同的酶耦聯物,HRPAP。比較而言,前者更經濟、快速、穩定,而后者較前者更為靈敏,通常情況下,HRP廣泛應用于免疫組化,western blot 和 ELISA 中,而堿性磷酸酶(AP)更適合于固相的免疫檢測實驗,如ELISAwestern blot.


熒光基團:


1.FITCFITC是廣泛使用的熒光基團,但其大的缺點是淬滅快,使用抗淬滅劑可以減輕。


2.AMCA:常用在多標記實驗中,如免疫熒光、流式細胞術。其缺點是,淬滅快,且由于肉眼不能很好的檢測其所激發的藍色熒光,因而AMCA耦聯的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。


3.花青染料(Cy2,Cy3,Cy5):Cy2FITC更穩定,且在表面熒光顯微鏡下,Cy2的熒光FITC更強。Cy3Cy5比大多數熒光基團更亮,更穩定,背景更弱。二者常在共聚焦顯微實驗中作多標記。但Cy5的缺點是不能用表面熒光顯微鏡觀察,因此通常用具有遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡觀察。


4.TRITC,RRX,TR:TRITC經常和FITC一起用于雙標記實驗中,也可以使用RRXTR,但TR會產生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記實驗時,RRX尤其有用,可以和Cy2(或FITC)及Cy5一起使用,因為RRX的發射波長在Cy2Cy5中間,且和這兩者的重疊很少。


5.PE:常和FITC一起用于流式細胞術雙標記實驗。


6.生物素:生物素(biotin)可以和抗生素蛋白(avidin)發生不可逆反應而緊密結合在一起。首先加入生物素標記的二抗,在加入耦聯有酶或熒光集團的avidin、ExtrAvidinstreptavidin,后者能夠結合于二抗表面的多個位點上,從而極大的放大檢測信號。

 

*本文內容來自網絡



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